مشکلات احتمالی تکنیک وسترن بلات و راه حل
مطلب مرتبط:
وسترن بلات(Western blot) |توضیح کامل تئوری و مراحل عملی|بیوتکنولوژی
روش بلاتینگ نیمه خشک (سمی درای) | Semi-dry blotting
رفع اشکال تخصصی روش بلاتینگ نیمه خشک (سمی درای) | بیوتکنولوژی
توضیح کامل تکنیک SDS-PAGE + رفع اشکال تکنیک الکتروفورز عمودی
انتقال ضعیف پروتئین ها در بلاتینگ
دلیل:بالا بودن درصد ژل در الکتروفورز
حل:الکتروفورز در ژل نازک تر صورت گیرد.
دلیل:احتباس حباب های هوا در حد فاصل ژل و غشا
حل: اجزای بلات کاملا در بافر انتقال به تعادل برسند. بعد از افزودن هر لایه از مجموعه بلات حباب های هوا با لوله آزمایش (به عنوان وردنه) خارج گردد.
دلیل:کم بودن زمان انتقال
حل: انتقال در ولتاژ پایین تر در طول شب انجام گیرد.
دلیل:بالا بودن درصد متانول در بافر انتقال
حل: درصد متانول را به 5-10 درصد کاهش دهید.
دلیل:بالا بودن غلظت دترجنت ها (مثلا SDS)
حل: غلظت SDS در بافر انتقال را کاهش دهید.
دلیل: کاهش دانسیته بار منفی در پروتئین ها
حل: بافر با PH بالاتر انتخاب گردد.مقدار کمی SDS نیز به آن اضافه گردد.
دلیل: ضعیف بودن قابلیت اتصال غشا
حل: از غشای تعویض کننده یون یا غشای نایلون استفاده شود.
مشکل: رنگی شدن زمینه غشا در وسترن بلات
دلیل: عدم وجود توین -20 در بافرهای رقیق کننده و شوینده
حل: توین-20 در غلظت 1/0-05/0 درصد به بافر اضافه گردد.
دلیل: مسدودسازی ناقص (غلظت کم ماده مسدود کننده و یا زمان مسدودسازی)
حل: درصد ماده مسدود کننده و یا زمان مسدودسازی افزایش یابد.
دلیل: نا مناسب بودن پروتئین مسدودکننده (دارای ناخالصی های آنزیمی یا واکسن با آنتی بادی ها)
حل: نوع پروتئین مسدود کننده تغییر یابد یا از دترجنت ها استفاده شود.
دلیل: بالا بودن غلظت اولیه آنتی بادی اولیه و یا ثانویه (کانژوگه)
حل: آنتی بادی ها در رقت های بالاتر مورد استفاده قرار می گیرند.
دلیل: نا خالص بودن آنتی بادی ها و یا خراب شده کانژوگه ها
حل: از انواع خالص تر آنتی بادی استفاده شود. کانژوگه تازه تهیه گردد.
دلیل: ناکافی بودن مراحل شستشو و یا طولانی نشدن مدت انکوباسیون غشا در سوبسترای آنزیم
حل: مراحل شستشو و بطور کامل و به دقت صورت گیرد. مرحله انکوباسیون غشا در سوبسترای آنزیم به مدت 20-5 دقیقه کافی است.
مشکل: لکه ها یا نواحی سفید در بلاتینگ ممکن است در اثر گیرافتادن حباب و یا نواحی خیس نشده غشا باشند که پروتئین به آنها متصل نخواهد شد. هر دو مورد را می توان با دقت رفع نمود.
دلیل: دلیل آن می تواند سر هم نمودن ناصحیح ساندویچ وسترن و یا گیر افتادن حباب هوا در آن باشد.
مشکل: وجود زمینه بسیار تاریک در بلات:
دلایل:بلاک شدن ناقص غشا:
- افزودن غلظت مسدود کننده
- افزودن مدت زمان مرحله مسدود کردن
- افزایش دمای مرحله مسدود کردن
- استفاده از ماده مسدود کننده دیگر
آلودگی محلول مسدود کننده
راه حل:
- استفاده از یک پروتئین خالص مانند BSA یا کازئین به عنوان بلاک کننده
- از بافرهای بلاک کننده استفاده نکنید.
انکوباسیون با سوبسترا به مدت طولانی
راه حل:
- مدت زمان انکوباسیون با سوبسترای تشخیصی کم شود.
در صورتی که از ماده رنگ دار استفاده می شود، هنگامی که سطح نویز به سیگنال قابل قبول است بلات را از محلول سوبسترا بیرون آورده و در آب دیونیزه قرار دهید.
مقدار آنتی بادی زیاد است
راه حل:
- غلظت انتی بادی اولیه و یا ثانویه را کاهش و یا تعدیل نمایید.
- از یک تست آزمایشی دات بلات استفاده نمایید تا غلظت های آنتی بادی بهینه گردد.
- مدت زمان انکوباسیون را کم نمایید.
مشکلات مخصوص تانک بلاتینگ
- پروتئن بیش از اندازه بارگیری شده است.
- مقدار پروتئین بر روی ژل را کاهش دهید.
- غلظت SDS در بافر انتقالی را کاهش دهید.
- یک غشای دیگر اضافه کنید تا پروتئین اضافی به آن متصل گردد.
اتصال آنتی بادی به پروتئین ها در بافر مسدود کننده:
راه حل:
- استفاده از مواد مسدود کننده دیگر، مثلا: آلبومین، ژلاتین ، BSA ، کازئین و شیر خشک بدون چربی
در هنگام استفاده از سیستم بیوتئین- آویدین از شیر به منظور بلاک نمودن غشا ها استفاده نکنید. زیرا شیر حاوی بیوتئین می باشد.
زمان ناکافی بین گام های انکوباسیون
- افزایش مدت زمان و تعداد گام های شستشو (حداقل 5×5 دقیقه)
- از مقادیر بیشتر بافر شستشو استفاده کنید.
خشک شدن غشا در زمان گام های انکوباسیون بلاتینگ
راه حل:
- مطمئن شوید غشا کاملا در هنگام شروع فرایند خیس شده است و نیز مطمئن شوید که بلات در هر مرحله خشک نمی شود.
- مطمئن شوید که غشا در زمان انکوباسیون و شستشو با بافرها کاملا غوظه ور است.
از بین رفتن فعالیت آنتی بادی در اثر نگهداری بلند مدت
راه حل:
- استفاده از آنتی بادی تازه که در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شده است.
- در صورتی که قرار است برای مدت زمان خیلی طولانی از آنتی بادی استفاده شود، بهتر است که آن را در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری کرد و آن را به بچ های خیلی کمی تقسیم نمود.
- از سیکل های فریز-دفریز آنتی بادی خودداری شود.
دمای انکوباسیون خیلی بالا
راه حل: استفاده از دمای انکوباسیون پایین تر
در صورتی که کاغذ PVDF دارای پس زمینه بیشتری نسبت به نیتروسلولز است، از نیتروسلولز استفاده کنید.
در صورتی که بافر آلوده است:
- از بافر تازه استفاده کنید .
- همه بافرها را قبل از استفاده با فیلتر 2 میکرومتری فیلتر نمایید.
مشکل: پس زمینه لکه لکه
این مشکل می تواند ناشی از غشای خشک و یا شستشوی ناکافی باشد. هر دو مساله به راحتی قابل حل هستند اگر بلات را کاملا و در تمام مدت غوطه ور نگه داشت. باید در جابجایی دقت بیشتری شود تا از چنین آلودگی در آزمایشگاه ها جلوگیری شود.
نقاط ناهموار بر روی بلات و یا پس زمینه خالدار
پس زمینه خالدار و لکه ای می تواند به دلیل اتصال یک جسم خارجی به غشا، تجمع آنتی بادی، اسکنر کثیف و یا سطوح کثیف کاست های وسترن بلات باشد.
انتقال کاست های ژل بر روی بلات
دلیل مشکل:
- استفاده از پدهای فیبری باریک و یا آلوده
- مقادیر اضافی از پروتئین بر روی ژل بارگیری شدند و یا SDS خیلی زیادی در بافر LOADING استفاده شده است.
- بافر انتقال آلوده است.
آموزش تکنیک وسترن بلات (Western blot) _ زبان انگلیسی
آموزش تکنیک وسترن بلات(Western blot) _ زبان انگلیسی 2
♦♦♦ در صورت داشتن هرگونه سوال در مورد این موضوع برای ما نظر بگذارید (در پایین همین صفحه). در اسرع وقت به تمامی سوالات شما توسط کارشناس مربوطه پاسخ داده خواهد شد. با تشکر ♦♦♦
مطالب مشابه:
دستگاه فرمانتور | بیوراکتور چیست؟
اصول PCR و کاربردهای آن، طراحی پرایمر
کامل ترین مجموعه کروماتوگرافی |انواع و روشهای کروماتوگرافی| بیوتکنولوژی
فیلم آموزشی کار با نرم افزار آنالیز تصاویر Image J
معرفی چند کتاب مهم در زمینه بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک | دانلود با لینک مستقیم
